单细胞藻种质分离、培养和应用的

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中国科学院海洋研究所海洋生物种质库

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第一章        常见单细胞藻的生物学简介

第一节        绿藻

一、        扁藻

扁藻属绿藻门，绿藻纲，团藻目，衣藻科，扁藻属。常用种类有青岛大扁藻和亚心形扁藻。
形态特征：亚心形扁藻的藻体一般扁压，细胞前面观广卵形，前端较宽阔，顶端前部凹陷。鞭毛4条由凹陷处生出。细胞内有一个大型、杯状、绿色的色素体，后端有一个呈内上开口的杯状蛋白核，有一个到数个红色眼点比较稳定地位于蛋白核附近、细胞中间略前。原生质体里有一个细胞核。细胞外有一层薄薄的纤维质细胞壁。细胞长11~16微米，宽7~9微米，厚3.5~5微米。能快速活泼游动。
繁殖方式：无性繁殖，细胞纵分裂形成2个（少数情况下4个）子细胞，环境不良时形成休眠孢子。
生态条件：
1、盐度  亚心形扁藻为广盐性，在8‰~80‰盐度的水中均能生长繁殖。最适盐度在30‰~40‰之间。
    2、温度  亚心形扁藻为广温性，在7~30℃的范围内均能生长繁殖，最适范围在20~28℃之间。
3、光照  亚心形扁藻在光照强度为1000~20000勒克斯范围内都能生长繁殖，最适光照强度约在5000~10000勒克斯之间。
4、酸碱度  一般在pH6~9的范围内均能生长繁殖，最适范围约在pH7.5~8.5之间。绿藻门的藻类在含有机质丰富的水中生长良好。

二、        盐藻

盐藻属绿藻门，绿藻纲，团藻目，盐藻科，盐藻属。主要培养种类是盐藻，又称杜氏藻。
形态特征：盐藻没有细胞壁，细胞外只有一层弹性膜，所以体形变化很大，有梨形、椭圆形、长颈形和纺锤形等。细胞内有一个杯状的色素体，色素体内的色素主要是叶绿素，生活条件不良时产生血红素，藻体呈红色。在色素体内靠近基部有一个大的蛋白核，有一个红色眼点位于细胞上部。原生质体中央有一个细胞核。前端生出两条等长的鞭毛，鞭毛比细胞长约1/3。细胞长16~24微米，宽10~13微米。
繁殖方式：无性繁殖，细胞纵分裂形成2个子细胞，环境不良时行有性生殖。
生态条件：
1、盐度  盐藻在高盐度水中生长特别好。最适盐度在60‰~70‰之间。
    2、温度  盐藻为广温性，可在4~40℃的范围内存活，最适范围在25~35℃之间。
3、光照  盐藻对光的适应性较强，最适光照强度约在2000~6000勒克斯之间。
4、酸碱度  一般在pH7~9的范围内均能生长繁殖，最适范围约在pH7.0~8.5之间。

三、        小球藻

小球藻属绿藻门，绿藻纲，绿球藻目，卵孢藻科，小球藻属。常见的有核蛋白小球藻、眼点小球藻、卵形小球藻、盐生小球藻和海生小球藻等。
形态特征：球形或广椭圆形。细胞内具有杯状（核蛋白小球藻）或呈边缘生板状（卵形小球藻）的色素体，核蛋白小球藻的色素体中有一个球形的蛋白核，细胞中央有一个细胞核。细胞大小依种类有所不同，核蛋白小球藻的细胞直径3~5微米，在人工培养的情况下，生长良好时，细胞会变小。
繁殖方式：以拟亲孢子的方式行无性繁殖。首先在细胞内部进行原生质体分裂，成为多个孢子，然后这些孢子破母细胞而出，每个孢子长成一个新个体。
生态条件：小球藻的生态条件依种类而不同。
1、盐度  海水小球藻对盐度的适应性很强，可以在河口、港湾、半咸水中生长繁殖。
    2、温度  一般的小球藻在10~36℃的温度范围内都能比较迅速地繁殖，最适范围在25℃左右。
3、光照  最适光照强度约在10000勒克斯左右。
4、酸碱度  最适范围约在pH6~8之间。小球藻在有机质丰富（特别是氮肥）的水中生长特别繁茂。

四、        微绿球藻

微绿球藻（Nannochloropsis oculata）属绿藻门，绿藻纲，四胞藻目，胶球藻科。
形态特征：细胞球形，单独或集合。色素体一个，淡绿色，侧生。眼点淡橘红色。在生长良好的情况下，色素体很深，不容易观察到眼点。没有蛋白核。有淀粉粒1~3个，明显，侧生。细胞壁级薄，细胞分裂时细胞壁与细胞之间形成空隙。
繁殖方式：进行二分裂繁殖，母细胞分裂成二个子细胞，子细胞由母细胞的细胞壁断裂处脱出，子细胞附着在细胞壁上，成为一个松散的树枝状群体。
生态条件：小球藻的生态条件依种类而不同。
1、盐度  微绿球藻对盐度的适应性很广，可以在4‰~36‰的范围中生长繁殖，并可保存在2‰~54‰的水中。
    2、温度  微绿球藻在10~36℃的温度范围内都能比较迅速地繁殖，最适温度范围在25-30℃。
3、光照  最适光照强度约在10000勒克斯左右。
4、酸碱度  最适范围约在pH7.5~8.5之间。微绿球藻在有机质丰富，特别是氮肥多，氨盐丰富的水中生长特别繁茂。

五、        塔胞藻

塔胞藻在分类上属于绿藻们，绿藻纲，团藻目，衣藻科，塔胞藻属。
形态特征：塔胞藻的藻体多数梨形、侧卵形，少数半球形。顶端具一圆锥形凹陷。鞭毛4条由凹陷处生出。杯状色素体，少数网状。有一个蛋白核，眼点位于细胞的一侧或无眼点。单核，位于细胞的中央偏前端。细胞不具细胞壁。
塔胞藻易于培养，一般采用扁藻的培养条件和培养液配方。其耐温下限比扁藻低。细胞生长良好时集群上浮，形成如扁藻一般的藻团。

第二节        硅藻

一、        三角褐指藻
三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum Bohlin）在分类上属于硅藻们，羽纹藻纲，褐指藻目，褐指藻科，褐指藻属。
形态特征：褐指藻有卵形、棱形和三出放射形三种。这三种不同的形态可以在不同的生长条件下转化。在正常的培养条件下，主要是三出放射形和少量的棱形细胞，这二种形态都没有硅质的细胞壁。三出放射形细胞长度约为10~18微米，棱形细胞长约20微米，两臂末端较钝。卵形细胞长约8微米，宽3微米，只有一个硅质壳面，也没有壳环带。
繁殖方式：一般是通过细胞平行分裂形成2个形态相同的子细胞。因为没有硅质壳，所以分裂是与一般的硅藻不同，藻体不会缩小。
生态条件：
1、盐度  广盐性，在9‰~92‰盐度的水中均能生长繁殖。最适盐度在25‰~32‰之间。
    2、温度  在5~25℃的范围内均能生长繁殖，最适范围在10~20℃之间。
3、光照  光照强度为1000~8000勒克斯范围内都能生长繁殖，最适光照强度约在3000~5000勒克斯之间，在小型培养时忌阳光直射。
4、酸碱度  一般在pH7~10的范围内均能生长繁殖，最适范围约在pH7.5~8.5之间。

二、        小新月菱形藻

小新月菱形藻（Nitaschia closterium minutissima Allen et Nelson）是新月菱形藻的一个类型，俗称“小硅藻”。在分类上属于硅藻门，羽纹纲，双菱形目，菱形藻科，菱形藻属。
形态特征：细胞纺锤形，中央膨大，两端渐尖，朝同一方向弯曲成月牙形。细胞长度约为12~23微米，宽2~3微米。细胞中央有一个细胞核。2个色素体，黄褐色，位于细胞核的两侧。
繁殖方式：行纵分裂繁殖。
生态条件：
1、盐度  广盐性，在18‰~61.5‰盐度的水中均能生长繁殖。最适盐度在25‰~32‰之间。
    2、温度  在5~28℃的范围内均能生长繁殖，最适范围在15~20℃之间。
3、光照  最适光照强度约在3000~8000勒克斯之间，在小型培养时忌阳光直射。
4、酸碱度  一般在pH7~10的范围内均能生长繁殖，最适范围约在pH7.5~8.5之间。

三、        角毛藻

角毛藻的培养种类有牟氏角毛藻、钙质角毛藻、纤细角毛藻等。在分类上属于硅藻门，中心纲，盒形藻纲，角毛藻科，角毛藻属。
形态特征：细胞小形，细胞壁薄。大多数是单个细胞，也有数个细胞集成群体的。壳面椭圆形至圆形，中间略突起或少数平坦。壳环面呈长方形至四角形。环面观一般细胞大小是3.45~4.6微米×4.6~9.2微米。壳环带不明显。角毛细而长，末端尖。培养过程中细胞形态常有变化，细胞中间膨大，角毛缩短或消失。
繁殖方式：一般为无性的二分裂繁殖。环境不良是可形成休眠孢子，一个母细胞形成一个休眠孢子，也可形成增大孢子。
生态条件：
1、盐度  牟氏角毛藻为沿岸性半咸水种类，在2.56‰~35‰盐度的水中均能生长繁殖。最适盐度范围低于正常海水盐度。纤细角毛藻的最适盐度在15‰~35‰之间。
    2、温度  在5~30℃的范围内生长率随温度的上升而增加，超过3℃则开始下降。纤细角毛藻的最适范围在28~30℃之间。
3、光照  牟氏角毛藻在500~25000勒克斯的范围内均能生长繁殖，最适光照强度约在10000~15000勒克斯之间。
4、酸碱度  一般在pH6.4~9.5的范围内均能生长繁殖，最适范围约在pH8.0~8.9之间。

四、        中肋骨条藻

中肋骨条藻（Skeletonema costatum）在分类上属于硅藻门，中心纲，圆筛藻目，骨条藻科，骨条藻属。
形态特征：细胞为透镜形或圆柱形，直径6~7微米。壳面圆而鼓起，周缘有一圈细长的刺，与邻细胞的对应刺相连接组成长链。细胞核在细胞的中央。有1~10个色素体，但通常是2个。
繁殖方式：一般为无性的二分裂繁殖。增大孢子圆形，直径为母细胞的2~3倍。
生态条件：
1、盐度  在7‰~50‰盐度的水中均能生长繁殖。最适盐度范围在15‰~30‰之间。
    2、温度  在10~34℃的范围内均可生存，最适范围在20~30℃之间。
3、光照  在500~10000勒克斯的范围内均能生长繁殖，最适光照强度约在10000~5000勒克斯之间。
4、酸碱度  最适范围约在pH7.5~8.5之间。

第三节        金藻

一、        球等边金藻

球等鞭金藻（Isocrydid galbana）在分类上属于金藻门，普林藻纲，等鞭藻科，等鞭藻属。其中OA-3011是球等鞭金藻的一个高温品系。
形态特征：球等鞭金藻细胞裸露，形状多变，但大多数呈椭圆形，幼细胞有一略扁平的背腹面，侧面观为长椭圆形或长方形。鞭毛2条，等长，由细胞前端生出，其长度为细胞的1~2倍。鞭毛基部有液泡。细胞内有一二个侧生的色素体，其形状和位置往往随着细胞的变化而变化。有一个细胞核，通常位于细胞的中央。细胞长4.4~7.1微米，宽2.7~4.4微米，厚2.4~3微米。能活泼游动。
繁殖方式：主要行无性二分裂繁殖。环境不良时形成特殊的内生孢子，环境变好时，内生孢子分裂成16个新的藻体放出。
生态条件：
1、盐度  球等鞭金藻OA-3011在纯淡水中不能生长，从盐度0‰~10‰生长率急剧上升达到最高峰，以后直到30‰，其生长率几乎无变化，超过30‰生长减慢。
    2、温度  球等鞭金藻OA-3011在10~35℃的范围内均能生长繁殖，最适范围在20~28℃之间。
3、光照  球等鞭金藻OA-3011的最适光照强度约在7000~9000勒克斯之间。
4、酸碱度  一般在pH6~9的范围内均能生长繁殖，最适范围约在pH7.5~8.5之间。

二、        湛江等鞭金藻

湛江等鞭（Isochrysis zhangjiangensis）在分类上属于金藻门，普林藻纲，等鞭藻目，等鞭藻科，等鞭藻属。
形态特征：细胞卵形或球形，大小为6~7微米×5~6微米。细胞表面具有几层体鳞片，在细胞前端表面有一些小鳞片。鞭毛2条，等长，由细胞前端生出，二条鞭毛之间有一条附鞭。鞭毛基部有液泡。二片周边色素体呈金黄色，每个色素体内含一个无淀粉鞘而仅一层膜包围的蛋白核。一到几个白糖素颗粒位于细胞中部或前端。
繁殖方式：主要行无性二分裂繁殖。环境不良时形成胶群体。
生态条件：
1、盐度  最适盐度约在22.7‰~35.8‰之间。
    2、温度  在9~35℃的范围内均能生长繁殖，最适范围在25~32℃之间，达到37℃时死亡。
3、光照  在1000~31000勒克斯的光照范围内均能正常的生长繁殖，最适光照强度约在5000~11000勒克斯之间。
4、酸碱度  一般在pH6~9的范围内均能生长繁殖，最适范围约在pH7.5~8.5之间。

三、        绿色巴夫藻

    绿色巴夫藻（Pavloca viridis）在分类上属于金藻门，普林藻纲，巴夫藻目，巴夫藻科，巴夫藻属。
形态特征：绿色巴夫藻无细胞壁。正面观圆形，侧面观椭圆形至倒卵形。大小为6微米×4.8微米×4.0微米。细胞中上部生出2条不等长的鞭毛和一条附鞭。长鞭毛上有许多小的圆形鳞片覆盖，长度是细胞体长的1.5~2倍，短鞭毛光滑，不发达，仅0.3微米，向后弯曲成钩形，位于二鞭毛之间。一个色素体裂成二大片围绕着细胞。细胞核在细胞上部。无蛋白核和眼点。群体细胞成淡黄绿色至绿色。有微弱趋光性。
繁殖方式：行无性二分裂繁殖。
生态条件：
1、盐度  对盐度的适应范围极广，在5‰~80‰的盐度范围内都能生长，最适盐度约在10‰~40‰之间。
    2、温度  适温范围广，在-3℃不会冻死，在10~35℃的范围内均能生长繁殖。从15~30℃生长率变化很小。
3、光照  最适光照强度约在4000~10000勒克斯之间。

第四节        蓝藻

一、        螺旋藻

常用于培养的螺旋藻有钝顶螺旋藻、极大螺旋藻和盐泽螺旋藻。螺旋藻在分类地位上属于蓝藻门，蓝藻纲，藻殖段目，颤藻科，螺旋藻属。
形态特征：蓝藻类细胞无色素体，色素分布在原生质体外部的色素区，蓝绿色。原生质体内部有一无色的中央区，类似其他藻类的细胞核，但无核仁和核膜，因此螺旋藻是原核植物。钝顶螺旋藻为丝状体，藻丝螺旋状，无横隔壁，蓝绿色。藻丝宽4~5微米，长400~600微米。藻丝的顶端细胞钝圆，无异形胞。
繁殖方式：行无性二分裂繁殖，繁殖结果使藻丝长度迅速增加。钝顶螺旋藻主要靠藻丝断裂增加丝状体的数量，有时也形成“藻殖段”，藻殖段细胞分裂成新的螺旋状藻丝。
生态条件：
1、盐度  钝顶螺旋藻原生长在碱性水中，可以被驯化培养在正常的海水中。
    2、温度  最适范围在30~37℃之间。
3、光照  最适光照强度约在30000~35000勒克斯之间。
4、酸碱度  最适范围约在pH8.6~9.5之间。

第五节        黄藻

一、        异胶藻

异胶藻（Hdterogloea sp.）在分类上属于黄藻门，黄藻纲，异囊藻目，异囊藻科，异胶藻属。
形态特征：异胶藻细胞多为长圆形或椭圆形。一块侧生的黄绿色色素体，几乎占细胞的大部分。无蛋白核。细胞宽2.5~4微米，长4~4.5微米。
繁殖方式：行无性二分裂繁殖。
生态条件：
1、盐度  在盐度13‰~31‰的水中均能正常生长繁殖，最适盐度为20‰~29‰。
    2、温度  一般在8~35℃的范围内都能正常生长，最适范围在15~33℃之间。
3、光照  最适光照强度约在3000~5000勒克斯之间。
4、酸碱度  最适范围约在pH7.5~8.2之间。

第二章        藻种的分离技术

第一节        采样方法

水样可以取自任何有可能生长所需单胞藻的水体，通常在海岸边退潮后留下的小水洼中或者在养殖场、盐场等地方的小水坑中，生长有适合静水培养的单胞藻类，而且比较纯。在实验场、育苗场的一些水池、水桶中都有可能出现比较纯的藻类。采样时要同时测定水样的温度和盐度，供分离、培养时参考。
水样采回后，进行现微镜检查，如果需要分离的藻类比较多，可以立即进行分离。如果在水样中有需要的藻类，但是数量不多，就要进行预培养，待其繁殖起来后再分离。预培养可以用500ml的三角烧瓶，加入150ml的培养液，然后把经350目筛绢过滤的水样150ml接种进去，在一定的温度和光照下静止培养，每天摇动1~2次。用作预培养的培养液，可选择各类藻类通用的培养液配方或者同时采用几种不同藻类的培养液同时分别培养。预培养的培养液的浓度应小些，一般只用原配方的1/2或1/4。如果要分离的藻类的最适生长条件是已知的，那就在其最适的光照和温度下培养。如果不知其最适生长条件，那就在人为设定的条件下培养，以便适应应用时的特定环境。

第二节        分离方法

一、        微吸管分离法

用直径0.5厘米、长35厘米的普通玻璃管，在中央部分加热，拉长6~10厘米，使玻璃管的直径缩小至0.06~0.1厘米，把它折断后即成二个吸管。把一团棉絮塞进吸管的宽大一端，然后放入高压灭菌器中消毒。消毒后，再在酒精灯上加热吸管的细端，用镊子拉成极细的微管，直径缩小至0.08~0.16毫米即可。微吸管在入水的瞬间，因毛细管的作用会吸入微量的水。将藻液水样放在凹玻片上，在显微镜下用微吸管仔细地吸出单个藻体，滴在载玻片上，在显微镜下确认是所要分离的单个藻体后，移入经灭菌的培养液中培养。

二、        平板分离法

按所要分离的藻类的特性，选用合适的培养液，在培养液中加入1~1.5%的琼脂，加热将琼脂溶化。加热后要加淡水补充蒸发掉的水分。然后，按照微生物学中固体培养基的制作方法倒平板、灭菌。
在无菌操作箱中，用接种针蘸取少量藻液，在固体培养基上划蛇形线，藻细胞就会散布在琼脂培养基的表面。
另一种使藻细胞散布在培养基表面的方法是用医用口腔喷雾器，将经稀释的藻液喷在培养基的表面。
将接种好的培养皿放在有适合的光照和温度的地方培养。一般经过十来天的培养就会在培养基上长出相互间隔的藻落。通过显微镜检查，找出所要的纯的藻落，再用已消毒的接种针从培养基上挑取藻体，移入经灭菌的培养液中培养。

三、        水滴分离法

    先将欲分离的藻液稀释，用微吸管将少量藻液吸出，滴在载玻片上，每张载玻片上可以滴数滴。水滴大小以在低倍显微镜下一个视野能包括整个水滴为准。在显微镜下逐个观察水样，挑选水滴中只有所要分离的单个藻体，而没有其他任何杂藻或小动物的，移入经灭菌的培养液中培养。
四、        稀释分离法

用已消毒的试管5支，在第一支试管中加蒸馏水10毫升，第二和第五支试管都加5毫升，用高压蒸汽消毒，待冷却后，在第一支试管中滴入混合藻液1滴，充分震荡，使其均匀稀释。再用经消毒的吸管从第一支吸管中吸取5毫升到第二支吸管中，充分震荡后再取5毫升到第三支试管中，如此直至第五个试管。再取5个已装有消毒的培养基的培养皿，加热使培养基熔化，待冷却而尚未凝固时，分别滴入5个试管中的藻液各1滴，用力震荡，使藻液充分混入培养基中。等冷凝后将培养皿放在适合的条件下，直到培养基中出现藻落。在稀释适当的培养皿内，藻落和细菌群落会充分分离。再在无菌条件下将选取单个藻落接种到固体培养基的表面，再培养。重复数次，直至得到纯的藻落。

第三章        藻种的保存技术

保存藻种时可以根据保种目的和保种条件的不同分别采取不同的保种方法。

第一节        固体培养基保存法

此法通常把藻种接种在固体培养基上，在弱光低温条件下保存，接种一次可以保存半年到一年。
保种用的固体培养基的营养浓度应比正常的液体培养液的高，一般增加一倍。琼脂量为1~1.5%。保种用的培养容器可用三角烧瓶、试管和克氏扁瓶。固体培养基分装灭菌后，冷却待用。
将无污染的藻种用喷雾法或划线法接种到固体培养基上，在弱光条件下，让细胞在培养基上慢慢地生长繁殖，可保存半年到一年。
可进行低温保存的藻种，最好在低温环境中保存。接种后，首先放在光线充足的地方（防止直射光照射），使藻类细胞较快速地繁殖起来，直到培养基上出现颜色，即可放入冰箱或冷库中，一般在5℃左右的低温下保存。当然，不同的藻种保存的温度也不尽相同。每天应给藻种几个小时的弱光照。此法保存的时间可长达2至3年。如新月菱形藻可保存34个月，三角褐指藻可保存25个月，角毛藻和骨条藻可保存9个月。

第二节        循环移养保存法

此法采用的容器一般为三角烧瓶（300毫升、500毫升、1000毫升等）和细口瓶（10000毫升、20000毫升等），将容器、工具消毒后，加入正常浓度的培养液，接种后瓶口用消毒的滤纸包扎，放在适宜的温度和光照条件下培养。白天摇动瓶子数次。一般5~10天即可移样一次。此法简单、容易掌握，而且保存的藻种活力强、纯度高、数量大。

第四章        单胞藻的丰富培养技术

第一节        容器、工具的消毒

为防止单胞藻在培养过程中被污染，培养用的容器和工具都必须经过消毒。消毒和灭菌的定义是有区别的。灭菌是指杀死一切微生物，包括营养体和芽孢；消毒则只杀死营养体，不杀死芽孢。保种需达到灭菌的程度，而生产性培养只需消毒就可以了。常用的消毒方法有高温消毒法和化学药品消毒法。

一、        高温消毒法

高温消毒法是利用高温杀死微生物的方法。不耐高温的容器如塑料和橡胶制品等不能利用高温法消毒。
1、直接灼烧灭菌  接种环、镊子等金属小工具，试管口、瓶口等可以直接在酒精灯火焰上灼烧灭菌。载玻片、小刀等则最好先蘸酒精，然后在酒精灯火焰上点燃，等器具上的酒精烧完，也就完成了灭菌操作。
2、煮沸消毒  把容器、工具放入锅中，加水煮沸消毒，一般煮沸5~10分钟。大型锥形瓶消毒，可在瓶口上放一普通的玻璃漏斗，再在漏斗上放一称量瓶盖，在锥形瓶内加少量淡水，置电炉上加热煮沸5~10分钟，可使整个瓶壁消毒。消毒完毕即用消毒的纸或消毒的纱布包扎瓶口。此法适合消毒小型的容器工具。如果在水中加1%的碳酸钠效果更好。
3、烘箱干燥消毒  将玻璃容器、金属工具用清水洗干净后，放入烘箱。关闭烘箱门，打开箱顶上的通气孔，接通电源加热。当温度上升到120℃时，关闭通气孔，停止加热。如果进行纯培养，容器必须灭菌，当温度上升到105℃时，关闭通气孔，继续加热至160℃，保持温度，恒温2小时，然后停止加热。必须要等到温度下降到60℃以下，才能打开烘箱门。
4、高温蒸汽灭菌  AAAAAAA

二、        化学药品消毒法

在生产性大量培养中，大型容器、工具、水泥池等常用化学药剂消毒。
1、酒精  能使蛋白质凝固而起杀菌作用。浓度为70%时，酒精的杀菌能力最强。酒精消毒常用于中小形容器和工具，方法是用纱布蘸酒精在容器、工具的表面涂抹，几分钟后用消毒水冲洗。
2、高锰酸钾  高锰酸钾又称灰锰氧，紫色针状结晶，易溶于水，是一种强氧化剂，能使蛋白质变性，杀菌能力很强。高锰酸钾溶液要现用现配。消毒时将容器、工具等浸泡在新配的300ppm浓度的高锰酸钾溶液中5分钟，然后取出用消毒水冲洗2~3次。如果是对玻璃钢水槽、水泥池等消毒，可以用0.05%浓度的高锰酸钾溶液拨在池壁上，拨洒几遍后刷洗池底，10分钟后再用消毒水冲洗干净。
3、石炭酸  石炭酸主要破坏细胞膜，并使蛋白质变性。消毒按3%~5%的比例配成消毒液，把要消毒的容器和工具放在其中浸泡半小时，再用消毒水冲洗2~3次。
4、盐酸  取工业盐酸1份，加淡水9份，配成10%的盐酸溶液。容器、工具放入盐酸溶液中浸泡5分钟，取出用消毒水冲洗2次。
5、漂白粉或漂白液  工业上用的漂白粉一般含有效氯30%~35%，消毒时配成含有效氯为0.01%~0.03%的溶液，把容器、工具在溶液中浸泡半小时再用消毒水冲洗3~4次即可。

第二节        培养用海水的消毒

消毒海水时可根据培养的目的和方式选用以下方法之一。
1、加热消毒法  经沉淀、过滤的海水，一般加温至90℃左右维持5分钟或达到沸腾即可。由于海水中的一些对藻类生长有促进作用的有机物在高温时易遭破坏，所以加温时间不宜太长。
2、过滤除菌法  把经沉淀的海水先经砂滤，把大型生物和非生物杂质去除，再用陶瓷过滤罐过滤，除去微小生物。
3、次氯酸钠消毒法  按每立方米海水20毫克有效氯的量加入次氯酸钠溶液，充气10分钟后停气，经6~7小时消毒后，按每立方米水体25克的量加入硫代硫酸钠，强充气4~6小时，用硫酸-碘化钾-淀粉溶液测试，若无余氯即可使用。
4、紫外线消毒  有成型的紫外线消毒器可供选用。但此法不易杀灭较大的浮游动物。最好和过滤法结合使用。

第三节        接种

接种就是把作为藻种的藻液接入新配好的培养液中，进行丰富培养。接种的过程虽然简单，但要注意藻种的质量、藻种的密度、接入藻液的数量以及接种的时间等问题。
1、藻种的质量  藻种的质量对培养结果的影响很大，一般要求藻种无污染、生长旺盛、藻液的颜色正常、藻液中无沉淀、细胞无附壁。
2、藻种的密度和接种数量  藻种藻液的密度应达到或接近可以收获的密度。接种后藻细胞在新培养液中应该达到较大的密度，这样有利于细胞在培养液中形成优势群体，不易出现污染，缩短培养周期。一般来说小型培养时藻种液和新培养液的比例为1:2~1:3，而中继培养和大量培养时，其比例可以提高到1:10~1:20。
3、接种的时间最好在上午的8~10时，这个时间是藻类细胞代谢最旺盛的时候。而傍晚到夜间，多种藻类有细胞下沉现象，不宜接种。

第四节        培养

一、培养方式

    单胞藻的培养方式有多种多样，可以根据不同的培养目的和不同的培养条件来选择不同的方法。只要是能够充分满足单胞藻的生长条件，在培养期间没有污染，便于操作，能达到培养目的的方法就是可取的方法。常用的培养方法从不同的角度可以大概地进行以下分类。
1、纯培养和单种培养  纯培养即无菌培养，是没有任何其他一切生物的单种培养。单种培养是不排除细菌存在条件下的单一藻种的培养。
2、充气培养和不充气培养  充气培养一般是在高密度培养时采用，用充气的方式补充培养液中的二氧化碳。
3、开放式培养和封闭式培养  开放式培养的容器是敞开的，由于有充足的光照和空气流通，一般来说藻类的生长比较快，但是容易被污染。封闭式培养是将藻类培养在封闭的玻璃瓶、透明圆柱形容器、透明塑料薄膜袋等容器中，容器除了充气管、加液管和藻液抽出管外，不与外界接触。封闭式培养由于污染少，培养的成功率很高。
    4、一次性培养和连续培养  一次性培养是指培养液中的藻类长起来后一次性采收。如果当藻类达到一定的密度时只采收了一部分藻液，又加入新的培养液继续培养，成为半连续培养。连续培养一般为室内的封闭培养，有人工光源，充气，培养的藻类在优化的条件下快速生长繁殖，培养液从一端连续流入，一定密度的藻液则从另一端连续流出。连续培养的流量是可以人为控制的。
    5、小型培养和大面积培养  小型培养的目的是为生产性培养提供藻种。一般培养容器为1000~3000毫升的三角烧瓶，一消毒的白纸或纱布包扎瓶口，一般是不充气的封闭式一次性培养。比小型培养的规模大一些的是中继培养，目的是培养大量的高纯度藻种，为生产性培养提供大量的藻种，培养容器的体积在几升到几百升之间，一般是封闭式半连续培养。在大型的玻璃钢水槽、水泥池中的培养则是生产性的大面积培养，容易污染，往往是充气的开放式一次性培养。

二、日常管理

培养单胞藻的日常管理包括以下几个内容。
1、搅拌和充气  通过搅拌和充气使空气中的二氧化碳溶解到培养液中，促进藻类细胞的光合作用，另外可以帮助沉底的细胞上浮获得光照。在培养中可以根据具体情况分别采用摇动、搅拌或充气的方法。
2、调节光照  光强和光周期对藻类生长的影响非常大，培养时必须根据培养种类对光照的要求采取挡光、遮光或增加人工光照等措施使培养物得到适合的光照。
3、每一种藻类都有最适的温度范围，为了保证培养藻的快速生长，必须为其提供适宜的温度。如是室外的大面积培养，当季节变化，气温不适合原来培养的藻类时，必须更换其他适当的种类。
4、注意pH值的变化  随着藻类细胞对营养盐的不平衡吸收，培养液的pH值会发生变化，有时这种变化会在短时间内发生。当培养液的pH值超出藻类的最适范围时，就会抑制藻类的生长。因此，在日常管理中要格外关注培养液pH值的变化。可以用1当量浓度的盐酸溶液或氢氧化钠溶液来调节培养液的pH值。
5、防止污染  在开放式培养中，要注意防止污染。

三、生长情况的观察和检查

在日常培养工作中，必须每天定时全面地检查藻类的生长情况。藻类生长的好坏，可以通过以下观察得知。
1、颜色  颜色的观察很重要，绿藻类生长繁殖良好时，随着密度的增加，培养液由嫩绿到深绿色。三角褐指藻、新月菱形藻正常生长时藻液呈褐色，藻体悬浮于水中形成云雾状水团，随着密度的增加，由浅褐色到深褐色。金藻生长良好时呈金褐色。接种后，随着藻类的细胞浓度逐渐增加，正常情况颜色由浅变深。若颜色由深变浅则可能是由于环境因子不适宜引起的；若出现其他颜色，如蓝色、黄色、乳白色等，说明被污染了。
2、运动和沉淀  具有运动能力的藻类在水中有一定的分布特点。硅藻类生长良好时会在水中形成云雾状水团；金藻虽然有鞭毛，但运动缓慢，一般不会迅速上浮，而是形成趋光带，细胞群成线状上浮。当环境不适时，藻类会下沉形成沉淀，当环境变好时则上浮。如果在环境条件正常时藻液大量沉底，出现沉淀，而且经过搅拌后又很快下沉，则是不正常现象。
沉淀藻体的颜色如果保持原色，说明还没有死亡，有可能恢复正常生长。如果藻体变成灰白色，则藻类已死亡。造成藻类沉淀的原因是多方面的，但主要的原因是环境不良或营养不足使藻类的生长受到抑制。
3、附壁  生长良好的单胞藻不附壁，若附壁则说明环境不适，生长不良。
4、水面出现菌膜说明有细菌或真菌生长。

第五章        单胞藻的培养液

每一种单胞藻对营养的要求都有其独特性，因而需要有特定的培养液配方来满足特定藻类的营养需求。另外，即使是同一种藻，采取不同的培养方式时其营养盐的配方也可能是不一样的。

第一节        培养液配方

一般来说，在配制营养盐的海水中已经有藻类所需的各种营养成分。在配制培养液时只需添加某些在培养中容易缺乏的营养元素即可。国内外使用的单胞藻培养液的配方数量众多，这里仅介绍一些在生产性培养中常用的配方。

一、        海洋单胞藻培养液配方

    1、一般用培养液配方
NaNO3                           0.03克
CO(NH2)2                                   0.03克
KH2PO4                        0.005克
FeC6H5O7(1%溶液)               0.2毫升
维生素B1                      200微克
维生素B12                   200毫微克
人尿                           1.5毫升
海水                          1000毫升
培养绿藻、金藻、硅藻使用，培养硅藻时添加0.02克/升硅酸钠。
2、绿藻培养液配方
2.1  海洋3号扁藻培养液
NaNO3                           0.1克
K2HPO4                        0.01克
Fe(SO4)3  (1%溶液)               10滴
2Na3C6H5O7.11H2O                0.02克
海水                          1000毫升
    2.2  亚心形扁藻培养液
NaNO3                           0.05克
KH2PO4                        0.005克
FeC6H5O7  (1%溶液)             0.2毫升
维生素B1                      200微克
维生素B12                   200毫微克
人尿                           2毫升
海水                          1000毫升
3、硅藻培养液配方
3.1、湛江水产学院硅藻培养液
NaNO3                           0.08克
K2HPO4                        0.008克
FeC6H5O7  (1%溶液)             0.2毫升
Na2SiO3                         0.02克
维生素B1                      200微克
维生素B12                   200毫微克
人尿                           1.5毫升
海水                          1000毫升
培养三角褐指藻、小新月菱形藻、钙质角毛藻、牟氏角毛藻。
3.2、中肋骨条藻培养液
KNO3                           0.4克
Na2HPO4.2H2O                  0.04克
K2SiO3                         0.02克
Fe(SO4)3.7H2O                   0.014克
土壤提取液                      15毫升
“920”植物生长激素        4~5国际单位
海水                          1000毫升
    3.3  牟氏角毛藻配方
NH4NO3                          5~20毫克
KH2PO4                        0.5~1毫克
FeC6H5O7.3H20                  0.5~2毫克
海水                          1000毫升
4、金藻培养液配方
4.1  “f /2”培养液
NaNO3                           74.8毫克
NaH2PO4                        4.4毫克
Na2SiO3.9H2O                 8.4~16.7毫克
f /2微量元素溶液                    1毫升
f /2维生素溶液                    1毫升
海水                          1000毫升
    4.2  等鞭金藻OA-3011培养液（陈椒芬等）
NaNO3                           0.06克
K2HPO4                        0.004克
FeC6H5O7                       0.5毫克
Na2SiO3                         0.005克
维生素B1                   100~500微克
维生素B12                   0.5~1.5微克
NaHCO3                           1克
海水                          1000毫升

二、        微量元素溶液配方
    1、A5-B6微量元素溶液配方
A5：
H3BO3                     2.86克
MnCl2.4H2O                1.81克
ZnSO4.7H2O                0.22克
CuSO4.5H2O                0.08克
Na2MoO4                  0.021克
纯水                      1000毫升
H2SO4 （浓）                 1滴
B6
NH4VO3                   229.6毫克
Cr2(SO4)4.24H2O            960.2毫克
NiSiO4.6H2O               447.8毫克
Co(NO3)2.6H2O             493.8毫克
Ti溶液                       20毫升
0.2摩尔/升 H2SO4           1000毫升
Ti溶液配法：把736.6克草酸钛溶解于少量纯水中，加入氢氧化铵使成碱性，发生沉淀。用离心机将沉淀集中，用0.2摩尔的硫酸20毫升溶解。用量：每1000毫升培养液中加入A5、B6溶液各1毫升。
2、“f /2”微量元素溶液
   ZnSO4.4H2O                23毫克
   MnCl2.4H2O               178毫克
   CuSO4.5H2O                10毫克
   FeC6H5O7.5H2O               3.9克
   Na2MoO42H2O              7.3毫克
   CoCl2.6H2O                 12毫克
   Na2EDTA                   4.35克
   纯水                      1000毫升
每1000毫升培养液加1毫升。

三、        维生素溶液配方

    1、维生素溶液S3
硫胺素盐酸盐                0.05克
尼古丁酸（烟酸）            0.01克
泛酸钙                      0.01克
对氨安息香酸                 1.0克
维生素H                     0.1克
肌醇                         0.5克
叶酸                        0.2微克
胸（腺）间氮苯               0.3克
纯水                       1000毫升
每1000毫升培养液中加入1毫升。
2、“f /2”微生素溶液
  维生素B12                    0.5毫克
  维生素B1                     100毫克
  维生素H                      0.5毫克
  纯水                         1000毫升
1000毫升培养液中加入1毫升。

鬼手

太帅了，经典昂  急人所急送 人所需啊
！！！

幸福a流年

  谢谢楼主